Hastadan tek yada iki ayrı kaba (split) (split ejekülattaki amaç ejekülasyon esnasında ilk anda gelen ve içeriğinde daha fazla sayıda ve hareketli sperm hücrelerini barındıran kısmın daha sonra gelen sıvıyla dilüsyona uğramamasını sağlamaktır. Yapılan bazı bilimsel çalışmalar özellikle sperm sayısı kısıtlı hastalarda bu yöntemle daha verimli sonuçlar elde edildiğini göstermiştir. Günümüzde ise split ejekülasyonun hasta açısından çok pratik bir yöntem olmaması sebebiyle ejekülatın tek bir steril kaba toplanması tercih edilmektedir.) alınan ejekülat(semen) örneği 15-30dk.(likefaksiyon süresi; örneğin incelenebilmesi için gereken sıvılaşma süresi) 37C sıcaklıktaki bir dolap (etüv) içerisinde bekletilir. Daha sonra örnekteki sperm sayısı, hareketliliği ve morfolojik (şekilsel) özellikleri değerlendirilir.
Değerlendirmeyi takiben semen örneği yıkama işlemine alınır. İki aşamadan oluşan bu işlem yaklaşık 35-40 dk. sürer. (İşlemin amacı semen örneği içerisindeki sperm hücrelerinin diğer seminal plazma hücrelerinden (döküntü hücreleri) arındırılması ve sperm hareketlerinin arttırılarak döllemeye hazır hale getirilmesidir.)
Yıkama işlemi sonrasında hazırlanan örnek sperm hareketlerinin arttırılması amaçlı 37C sıcaklık ve %6CO2 (karbondioksit)(yapay vücut ortamına benzer ortam) içeren özel dolaplar (inkübatörler) içerisinde yaklaşık 30dk. bekletilir. Bu süre sonunda spermler bir enjektör yardımıyla kadının rahmine enjekte edilerek hareketliliği arttırılmış spermlerin katedecekleri yol kısaltılmış olur.
Aşılamada gebelik oranları çiftin kısırlık sebebine, kadının yaşına, stimülasyon protokolü (ilaç tedavisi) sonucunda oluşan folikül (yumurtanın içerisinde geliştiği hücreler) sayısına ve sperm parametrelerine bağlı olarak %15-25 arasında değişkenlik gösterir.
Hastaya tüp bebek yada mikroenjeksiyon (ICSI-Intra sitoplazmik sperm enjeksiyonu)uygulamasının kararı infertilite (kısırlık) sebebine, toplanan oosit (yumurta) sayısına ve sperm özelliklerine bağlı olarak belirlenir. Tüp bebek ve mikroenjeksiyon uygulamalarında hasta açısından uygulanması gereken prosedürler benzer olmakla birlikte IVF laboratuvarında yapılan işlemler farklıdır. Tüp bebekte anne adayından alınan yumurtalarla baba adayından alınan spermler özel bir kültür sıvısına birlikte koyularak inkübatör adı verilen özel dolaplar (yapay vücut ortamı sağlamak için 37C ve %5-6 karbondioksit içeren ortamlar) da 14-16 saat bekletilir ve bu süre sonucunda sperm hücrelerinin yumurtaları döllemeleri beklenir. Mikroenjeksiyonda ise tüp bebekten farklı olarak her bir yumurtanın içerisine tek bir sperm hücresi mekanik olarak yerleştirilir. Böylece spermin yapacağı göreve mikromanüplatör adını verdiğimiz aletler yardımcı olmuş olur. Günümüze kadar yapılan çalışmaların çoğunluğu tüp bebek ve mikroenjeksiyon sonrasında benzer gebelik ve implantasyon (transfer edilen embriyo başına rahme tutunabilen embriyo sayısı) oranlarının elde edilebildiğini göstermiştir.
Yumurta toplama işlemi sonrasında yumurtalar özel kültür solüsyonları içerisinde 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren özel inkübatörlerde matürasyonlarını (olgunlaşma) tamamlamak için 3-5 st.inkübe edilir.
Bu süreç içerisinde semen örneği yıkanarak işleme hazır hale getirilir ve dölleme işlemi yapılana kadar 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilir.
Süre bitiminde hazırlanan sperm örneğinden; sayı ve hareketliliğe bağlı olarak belirlenen bir konsantrasyonda oositlerin (yumurtaların) kültüre edildiği ortama bırakılır ve 14-16 saat döllenme işleminin gerçekleşmesi için 37C sıcaklık ve %6CO2 li ortamda inkübe edilir.
Bir gün sonrasında yumurtalar çevrelerindeki hücrelerden arındırılarak döllenme kontrolü yapılır. Yumurta içerisinde dişi ve erkek çekirdeğinin gözlenmesi döllenme göstergesidir.
Yumurta toplama işlemi sonrasında oositler kültür solüsyonları içerisinde matürasyonlarını tamamlamak amaçlı 2-3 saat 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilir.
Bu süre içerisinde semen örneği hazırlanır.
Süre bitiminde yumurta çevresindeki hücreler mikroskop altında temizlenerek matürasyonları kontrol edilir. Genel dünya istatistiklerine göre toplanan yumurtaların %70-75'inin matür(olgun) olmaları gereklidir. Sadece olgun yumurtalara işlem yapılmalıdır. (İmmatür-olgun olmayan oositlerden özel kültür ortamlarında 2-24 saat içerisinde olgunlaşabilmiş olanlarına mikroenjeksiyon işlemi uygulanabilir. Fakat bu süreç içerisinde oositler canlılık kaybına uğrayabildikleri için elde edilebilen embriyolarla gebelik oranları daha düşüktür.)
Oositler çevrelerindeki hücreler temizlendikten sonra 1-2 saat daha 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilmeye devam edilir ve mikroenjeksiyon işlemi yapılır. Mikroenjeksiyon işleminin tüp bebekten en belirgin farkı mikroskop altında özel mikromanüplatörler yardımıyla tek bir spermin tek bir oosit içerisine mekanik olarak yerleştirilmesidir. Daha sonraki döllenme ve embriyo gelişim aşamaları benzerdir.
Döllenmeyi takiben 24 saat içerisinde yumurtalar 2-4 hücreli aşamaya 72. saatte 6-8 hücreli aşamaya 96.saatte morula adı verilen çok hücreli aşamaya ve 5-6.günlerde ise embriyonun rahme tutunmadan önceki son aşaması olan blastokist aşamasına ulaşabilirler. Döllenmiş yumurtalar 24.saatte bölünme aşamasına geçtikten itibaren morfolojik yapıları mikroskop altında incelenerek belirli bir sınıflandırma yöntemi ile kaliteleri gruplandırılır. Bu sınıflandırmada embriyonun o günkü olması gereken hücre aşaması(klivaj hızı), hücrelerin birbirine olan eşitliği, fragmantasyon adı verilen embriyo ileri gelişimini olumsuz yönde etkilediği gösterilmiş hücre içi atipik yapıların embriyo içerisinde bulunma yüzdesi, hücre içi görünümünün parlaklık ve homojenliği gibi özellikler dikkate alınır.Bu değerlendirmelere göre en iyi kalitedeki embriyolar o günkü olması gereken bölünme aşamasına ulaşabilmiş, hücre büyüklükleri birbirine eşit ve homojen görünümlü, hiç fragmantasyon içermeyen embriyolardır. (G1 embriyo) G2 embriyo:G1'den farklı olarak %20'nin altında fragmantasyon içeren; G3 embriyo hücreleri birbirine eşit olmayan %20-50 fragmantasyon içeren; G4 embriyo ise hücreleri eşit olmayan %50'nin üzerinde fragmantasyon içeren embriyolardır. Yapılan çalışmalar G1-G2 embriyoların transferi ile bu embriyoların gelişim potansiyellerinin daha yüksek olmasına bağlı olarak gebelik oluşma şansının G3-G4 embriyoların transferine göre daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bunun yanında G1 ve G2 arasındaki oranla G3 ve G4 arasındaki oranlar benzerdir. Embriyolar blastokist aşamasına ulaştıklarında kendi aralarında kalitelerine göre tekrar sınıflandırılırlar. Bu sınıflandırmada blastokistin gelişim hızı ve iç hücre tabakasının yapısı dikkate alınır.Bu gruplandırmaya göre iyi kalitede blastokistler BG1-BG2 (BG1 ve BG2 arasındaki tek fark BG1 blastokistlerin daha hızlı gelişmesidir.) ; kötü kalitede blastokistler ise BG3 olarak adlandırılır. BG1-BG2 blastokistlerin gebelik oluşturma şansları BG3 blastokistlere göre daha yüksektir.BG1 ve BG2 arasındaki fark ise benzerdir.
Embriyo transferi embriyo gelişiminin 2-6. günleri arasında yapılabilir. Günümüze kadar yapılan çalışmalar halen çelişkili olmakla beraber transfer gününe göre gebelik oranları benzerdir.
Blastokist döllenmiş yumurtanın ana rahmine tutunmadan ulaşmış olduğu son gelişim safhasıdır. Embriyonun çapı blastokist aşamasına ulaşırken giderek büyür ve dış kılıf incelir.Blastokist dış kılıfından sıyrılarak (hatched blastokist) rahmin iç tabakasına tutunur ve gebelik oluşturur. Günümüz kültür ortamlarında embriyoların ancak ortalama %45'i bu aşamaya ulaşabilmekte bu blastokistlerinde ancak %15-20'si hatched aşamaya kadar gelişimini devam ettirebilmektedir. Bu oranlar bölünme aşamasındaki embriyolar kötü kalitede olduğunda dahada düşmektedir.Bu sebeplerden dolayı blastokist transferi günümüz şartlarında ancak selektif hasta gruplarında uygulanması durumunda gebelik şansını arttırabilmektedir. (En fazla kabul gören endikasyonlar: En az iki başarısız IVF-ICSI siklusu olan ve embriyo gelişiminin son aşamaya kadar daha dikkatli gözlenmesi gereken hastalar, çoğul gebelik riski yüksek, genç ve fazla sayıda embriyosu olup gelişim potansiyeli yüksek embriyoların (blastokist) seçilebilip daha az sayıda embriyo transferi gerektiren hastalar)
Embriyoların koruyucu kültür solüsyonları (krioprotektanlar)içerisinde dengelendikten sonra özel bir alet ile kademeli olarak soğutularak dondurulması ve sıvı nitrojen (-196C) içerisinde depolanması işlemlerini içerir. Embriyo kalitesine ve hasta yaşına bağlı olarak transfer edilecek embriyo sayısı 2-4 arasında değişebilir. Hastanın transfer sonrasında(yada olumsuz klinik bulgulardan dolayı o siklusta hiç transfer yapılmadan) iyi kalitede daha fazla sayıda embriyolarının bulunması durumunda tekrarlayan siklusta transfer edilmek üzere bu embriyolar dondurulabilir. En iyi kalitede embriyolar dondurma işleminden minimal zarar göreceğinden dolayı (Dondurma çözme sonrasında embriyolarda canlılık oranı; %75 - %90 ) sadece iyi kalitede embriyolar dondurulur. Kötü kalitedeki embriyoların dondurulması durumunda yaşama olasılıkları çok düşüktür. (%20-%25) Dondurma işlemi transfer edilecek embriyoların seçimi sonrasında 2-6. Gün arasında yapılabildiği gibi döllenmenin gerçekleştiği günde uygulanabilir. Dünya istatistiklerine göre dondurulmuş embriyoların çözme sonrası transferi ile gebelik oranları %25-50 arasında değişmektedir. Bu oranlar klinik ve laboratuvar prosedürlerine ,hasta yaşına, infertilite sebebine, çözülen embriyo başına canlılık oranına göre değişkenlik göstermektedir.
Ejekülatında hiç sperm hücresine rastlanmamış (Azospermi) yada ejekülat spermlerinin hepsinin yada en az %80inin ölü olduğu hastalarda sperm hücreleri sperm üretiminin kaynağı olan testislerde yada epididimde (kanallarda) aranır.
Azosperminin sebebi kanallarda (epididim) tıkanıklık(obstrüktif azoospermi) ise kanallardan aspire edilen sıvı içerisinde laboratuvarda mikroskop altında spermin varlığı araştırılır. (MESA- mikroepididymal sperm aspirasyonu yada farklı bir yöntem olan PESA-perkütan epididiymal sperm aspirasyonu) Kanallarda sperm hücresine rastlanmazsa testis biopsisine geçilir.
PESA/MESA'da sperm bulunamayan olgularda yada azoospermi sebebi direkt olarak testis (yumurtalık) teki üretim bozukluğuna bağlı olan hastalarda (non-obstrüktif azoospermi) sperm hücresinin varlığı kanallardan alınan sıvı (epididim) yerine testisten parça alınarak araştırılır.
Testis biopsisi esnasında alınan doku parçası laboratuvarda mikroskop altında incelemeye alınır.
Doku parçası alınmış ise parça laboratuvarda tamamıyla ayrıştırılarak olası sperm hücrelerinin açığa çıkması sağlanır.
İnceleme bitiminde örnek yıkama işlemine alınır.Bu işlem iki aşamadan oluşup sperm sayısına göre 35-45dk. arasında sürebilir.
Testis biopsisi işlemi eşin yumurtalarının toplandığı gün yapılabileceği gibi 24 saat öncesinde de uygulanabilir. 24 saat öncesinde yapılması durumunda IVF laboratuvarında yıkanarak hazırlanan örnek 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren (amaç yapay vücut ortamı yaratmaktır) inkübatörlerde mikroenjeksiyon işlemine kadar inkübe edilebilir. Testis spermleri olgunlaşmamış hücreler olduğundan henüz hareket kabiliyetlerini kazanmamış olabilirler. Bu sebeple doku parçasının 24 saat önce alınması ve yıkanan örneğin inkübatörlerde bekletilmesi sperm hareket faaliyetinin başlaması açısından da yararlı olabilir.
Yardımcı üreme tekniklerinde kabul gören assisted hatching endikasyonları: İleri yaş (35 yaş ve üstü), en az bir kez tekrarlayan başarısız IVF-ICSI siklusu, yüksek bazal hormonal değerler, embriyo dış kılıfının normalden daha kalın olması ve kötü embriyo kalitesidir. Yöntem selektif olarak bu hasta gruplarında uygulandığında gebelik oranlarını arttırabilir. Bu endikasyon gruplarına dahil olmayan hastalara uygulanması durumunda gebelik oranları üzerinde etkisinin olmadığı yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Normal gelişimini tamamlayabilen bir embriyo rahmin iç tabakasına tutunmadan önce dış kılıfından sıyrılabilmelidir. Destekli yuvalama işleminde amaç embriyonun dış kılıfını transfer öncesinde bir miktar inceltebilmek böylelikle rahme tutunmasını kolaylaştırarak gebelik şansını arttırabilmektir. Bu işlem embriyo gelişiminin farklı aşamalarında uygulanabilir. (2-5.gün) Yapılan bilimsel çalışmalar henüz ilk bölünme safhasını yeni tamamlamış 2 hücreli embriyolarda assisted hatching işleminin hücre ileri gelişimini olumsuz yönde etkileyebileceğini göstermiştir. Bu sebeple assisted hatching işlemi 2 hücreli embriyolara uygulanmaz. Destekli yuvalama IVF laboratuvarında farklı metodlarla uygulanabilir. ör:lazer ışınları kullanarak, asidik solüsyonlarla eriterek yada sivri pipetler yardımıyla keserek. Yapılan bilimsel çalışmalarda farklı yöntemlerde benzer gebelik oranları bildirilmiştir. Günümüzde laser assisted hatching yönteminin en hızlı- pratik yöntem olması ve minimal düzeyde kullanıcı tecrübesi gerektirmesi en yaygın olarak kullanılmasına sebep olmaktadır.
